限制性內切酶可以特異地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異位點上，并切割雙鏈DNA。

       在平常酶切實驗中，

       總有一些因素導致結果不理想，

       那么做好酶切應該注意哪些問題呢？

       操作步驟中應注意哪些關鍵因素呢？

       ???

一、DNA質量

       ▲DNA的質量是決定酶切效率的最重要的因素。通常在克隆時，如果反復優化酶切條件后，都不能實現完全酶切，最可能的原因就是質粒DNA的質量有問題；

       ▲DNA的質量檢測通常有兩個方法：首先OD260/280比值應該在1.8左右（1.7-1.9），否則意味著DNA樣品中存在大量的蛋白質或RNA污染。其次，瓊脂糖電泳分析時應主要以超螺旋條帶為主，最多不超過三條帶（分別為超螺旋DNA，線性化DNA和環狀DNA），否則意味著質粒DNA的質量不高，應該重新制備。

二、樣品純度

       DNA中的雜質，如：氯仿、乙醇、SDS等，都會影響酶的活性。

       一般采取以下措施：

       ▲純化DNA；

       ▲加大酶用量；

       ▲延長酶催化反應的保溫時間；

       ▲擴大反應體系（＞20ul）。

三、甲基化影響

       從帶有DNA甲基化酶基因的宿主菌中制備的DNA，其堿基的一部分已經被甲基化，因此即便使用能夠識別、切斷被甲基化部分的序列的限制酶，也幾乎無法切斷被甲基化的部分。被甲基化的部位，根據底物DNA及宿主種類的不同而不同。例如宿主菌為大腸桿菌的情況下，根據宿主的種類有以下兩種情況：

       在進行轉化時，通常使用C600、HB101、JM109等菌株，因為都帶有dam、dcm甲基化酶，所以使用這些菌株制備的DNA時，必須注意！另外，動物DNA中CG序列多為5mCG，植物DNA中CG及CNG序列多為5mCG和5mCNG。

四、反應溫度

       大部分酶的反應溫度為37°C，從嗜熱菌中分離出來的內切酶則有更高的要求溫度，一般為50-65°C不等。

五、DNA分子結構

       DNA分子的不同構型對限制性內切酶的活性有很大影響，某些限制性內切酶在切割超螺旋的質粒時需要的酶量比切割線性DNA時要高很多。

六、緩沖液

       對于每一種酶都有相應的最佳緩沖液（不同公司的同一種buffer可以互換使用哦~），可保證幾乎100%的酶活性，所以應選擇合適的緩沖液，使用時的緩沖液濃度應為1X。有的酶要求100μg/ml的BSA才可實現最佳活性，在這種情況下，也相應有100X（如NEB公司）或10X（如Takara公司）的BSA，不需要BSA的酶如果加了BSA也不會受太大影響。

七、反應時間

       ▲對于酶切鑒定試驗（加酶量0.5-1μl，反應體系10-20μl，質粒DNA量在50-200ng），反應時間2-4h（如果時間比較緊的話可以1-2h）；

       ▲對于酶切后用于膠回收（加酶量1-2μl，反應體系30-50μl，DNA量在500-2000ng），反應時間3-6h；

       ▲對于反應條件不是很合適的時候(如雙酶切時有一個酶的反應buffer不是很合適或者酶切位點在線性DNA的末端)最長16h。

       ▲為防止Star活性的產生，應將甘油的濃度控制在5%以下，要注意酶的體積不要超過總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）。同時如果酶切時間過長可能會導致基因被切碎。

       不完全酶切或者完全切不開

       ▲可能原因?：內切酶失活

       ▲推薦解決方案：

       1.查看內切酶的有效期；

       2.確保內切酶儲存在-20℃，再低于此溫度，內切酶活性可能受影響；

       3.避免多次凍融（不超過3次），建議使用冰盒儲存或取放內切酶；

       4.勿將酶儲存于無霜冰箱或冰箱開門處：

       ▲可能原因?：酶切方案不佳

       ▲推薦解決方案：

       1.按照內切酶供應商推薦的酶切方案及其所適用的DNA樣本類型；

       2.確保酶切反應中包含所需的添加物或酶輔因子（如DTT、Mg2+、ATP、活性腺苷甲硫胺酸）；

       3.使用隨酶提供的酶切緩沖液。雙酶切時，按供應商的推薦，需考慮兼容性及其它所需反應條件；

       4.按照供應商推薦的最適酶切溫度進行酶切，雙酶切時若兩種內切酶最適溫度不一致，按順序先進行較低溫度酶切，再進行較高溫度酶切；

       5.確保酶切過程中不會因蒸發而使酶切體積減小，否則會使鹽濃度增高，從而可能降低酶的活性

       ▲可能原因?：內切酶不恰當的稀釋

       ▲推薦解決方案：

       1.避免使用微量體積（<0.5μL）內切酶進行酶切，保證足量日常儲備，確保每個反應所加酶量準確；

       2.勿將內切酶稀釋于水或10×反應緩沖液中；

       ▲可能原因?：配制酶切體系不恰當

       ▲推薦解決方案：

       1.在反應體系中最后加入內切酶，加入內切酶后輕彈混勻，確保內切酶不會因甘油密度而沉于管底；

       ▲可能原因?：酶切反應混合液中甘油過多

       ▲推薦解決方案：

       1.酶切反應混合液中甘油濃度應<5%，加入內切酶的量不超過總反應體積的1/10，尤其是對于雙酶切；

       2.避免因蒸發而使反應體積減小，從而導致甘油濃度增高；

       ▲可能原因?：酶切DNA濃度不合適

       ▲推薦解決方案：

       1.酶切反應混合液中DNA濃度的最佳范圍為20-100 ng/μL；

       ▲可能原因?：DNA污染

       ▲推薦解決方案：

       1.通過離心柱純化、酚氯仿抽提和乙醇沉淀去除殘留的SDS、EDTA、蛋白、鹽分、核酸酶，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀，以去除EDTA和鹽分；

       2.當酶切未經純化的PCR產物時，PCR產物體積應不超過酶切總體積的1/3（如30 μL酶切總體積中PCR產物體積不超過10 μL）；

       3.如果DNA是經硅膜或樹脂純化，需>10000×g離心10分鐘已去除殘余粒子；

       ▲可能原因?：DNA中找不到內切酶識別序列

       ▲推薦解決方案：

       1.重新檢查DNA模板，或通過測序檢查；

       2.如果通過PCR引物引入酶切識別序列，確保引物序列包含酶切識別序列且5’端有4-8個保護堿基；

       3.查看所用內切酶是否需要不止一個識別位點才能發揮完全活性，添加含識別序列的DNA寡核苷酸或亞精胺可提高那些至少需要兩個識別位點內切酶的活性（如AarI、SfiI）；

       ▲可能原因?：甲基化影響

       ▲推薦解決方案：

       1.查看內切酶的甲基化敏感性。如果內切酶受識別序列甲基化影響，嘗試用異裂酶或同裂酶替代（如MvaI替代EcoRII）；

       2.為了避免DNA的甲基化，在dam–/dcm–型大腸桿菌中復制質粒；

       3.如果內切酶需要識別序列甲基化才能發揮功能（如DpnI、SgeI），在dam+/dcm+型大腸桿菌中復制質粒；

       ▲可能原因?：DNA結構影響

       ▲推薦解決方案：

       1.對于超螺旋的質粒DNA，其酶切位點可能被包埋，使用經驗證可消化完整質粒的內切酶，如有必要，適當加大酶用量（如每μg DNA 5-10 units酶）；

       2.對于線性DNA而酶切位點臨近末端，檢查完全酶切所需的額外堿基；

       3.如果在質粒多克隆位點內進行雙酶切，檢查酶切位點臨近序列，是否具有進行完全酶切所需的堿基數量，如果距離太近，兩種酶切可能會互相影響；

       ▲可能原因?：水中有雜質

       ▲推薦解決方案：

       1.將水離心（10 min， 10000×g）以去除水中污染物；

       2.做陰性酶切對照，以水代替酶以檢測水中核酸酶和細菌污染物的影響；

       3.推薦使用新鮮的無核酸酶、分子生物學級別的商品化水；

       出現預期外的酶切條帶

       ▲可能原因①：內切酶星號活性

       ▲推薦解決方案：

       1.酶用量不要超過推薦用量，如有必要可適當減少酶用量；

       2.避免過度長時間酶切；

       3.使用推薦的反應緩沖液。低鹽、不合適的PH、除了Mg2+外的二價陽離子可能引起星號活性；

       4.確保酶切反應中甘油濃度不超過5%；

       5.避免因蒸發而使反應體積減小，進而增大甘油濃度和鹽濃度；

       ▲可能原因②：其它內切酶污染

       ▲推薦解決方案：

       1.使用一管新酶或新緩沖液，不恰當的實驗操作可能使內切酶或緩沖液被另一種內切酶污染；

       ▲可能原因③：其它DNA污染

       ▲推薦解決方案：

       1.重新制備新的樣本DNA；

       出現彌散的DNA條帶

       ▲可能原因?：DNA質量差

       ▲推薦解決方案：

       1.通過電泳檢測未酶切的DNA，如觀察到降解則重新純化DNA；

       ▲可能原因?：試劑污染

       ▲推薦解決方案：

       1.如有必要，制備新的試劑，使用新的內切酶或者重新純化DNA，不恰當的操作可能使反應組分被核酸酶污染；

       ▲可能原因?：DNA遷移緩慢

       ▲推薦解決方案：

       1.在電泳前加入含0.2% SDS上樣緩沖液后，將酶切DNA在65℃加熱10分鐘，可使與底物DNA仍結合的酶分離；